שאול טשרניחובסקי נולד בי"ט באב ה'תרל"ה (1875), בן לגוטמן ובילה, בכפר מיכאילובקה, בפלך טאורידה (טאברידה) שבדרום-מערב האימפריה הרוסית, ב"תחום המושב" היהודי (כיום באוקראינה). קדמה לו בת שמתה בילדותה, וגם בת שנולדה אחריו ומתה בילדותה, כך שהוא גדל זמן מה כבן יחיד. אחר כך נולדו להוריו עוד שני בנים ושתי בנות.

את ילדותו תיאר שאול טשרניחובסקי באוטוביוגרפיה קצרה שפרסם בשנת 1918 בכתב העת "השילוח",‏ ובהרחבה בחיבורו "מעין אבטוביוגרפיה" שכתב בשנותיו האחרונות.‏ אחדים מסיפורי ילדותו משתקפים בשיריו. מגיל חמש קרא ספרים ברוסית, שאותה למד מדודתו, ובגיל שבע למד עברית מאביו. תחילה למד בחדר מתוקן, ובגיל 10 עבר לבית ספר רוסי, ולמד בעצמו קריאת כתב רש"י. בשנת 1890 עבר לאודסה, שם למד עד שנת 1892 בבית ספר יהודי פרטי למסחר ובבית ספר כללי ללימודי שפות זרות. בשלב זה כבר כתב בלדות ופרסם את שיריו הראשונים. השירים הראשונים שפרסם היו "משאת נפשי", בכתב העת "השרון" של גרשום באדר, ו"בחלומי", בכתב העת "הפסגה" של זאב שור. בשנת 1893 עבר לבית ספר ממשלתי למסחר, שבו למד שלוש שנים וסיים בהצטיינות. בתקופה זו למד גרמנית, אנגלית וצרפתית. לאחר מכן למד גם יוונית ולטינית, כדי שיוכל להתקבל לאוניברסיטה.

בשנת 1898 יצא לאור ספר השירים הראשון שלו, "חזיונות ומנגינות". לימים יצא חלק שני של הספר. ההקדמה הייתה מאת המבקר ראובן בריינין, שהילל את המחבר.

בשנים 1899–1906 למד רפואה באוניברסיטת היידלברג, וסיים את לימודי הרפואה בלוזאן שבשווייץ. בעת לימודיו בהיידלברג נישא למלַניה קרלובנה פון גוזיאס-גורבצביץ (1879–1971), בת אצולה נוצרייה רוסייה ממוצא פולני-גרמני-אוקראיני, שישבה בבית-הסוהר ברוסיה על רקע פעילות אנרכיסטית והגיעה ללמוד היסטוריה ופילוסופיה בהיידלברג. לבני הזוג נולדה בת יחידה, איזוֹלְדה (איזה).‏ בשנת 1907 נעצר לשישה שבועות על פעילות פוליטית.

מעת סיום לימודיו ועד סוף ימיו שילב את פעילותו כרופא עם פעילותו כמשורר. לאחר סיום לימודיו חזר לאוקראינה, והיה רופא בחארקוב ובקייב. בשנת 1910 עבר לסנקט פטרבורג ופתח בה מרפאה. במלחמת העולם הראשונה שימש רופא צבאי במינסק ובסנקט פטרבורג. בשנת 1919 עבר לאודסה.

בשנת 1922 הגיע לקושטא, אך בקשתו לקבל משרת רופא בארץ ישראל לא נענתה. ב-1923 עבר לברלין. ב-1925 ביקר לראשונה בארץ ישראל, לרגל ייסוד "מגן דוד אדום".

בשנים 1925–1932 נמנה עם עורכי העיתון "התקופה" וכן ערך מדור רפואה באנציקלופדיה העברית אשכול. בשנים 1929–1930 שהה בארצות הברית וב-1931 (ב' בסיוון תרצ"א) עלה לארץ ישראל והשתקע בה לצמיתות. הוא קבע ביתו בדירה קטנה ברחוב אחד העם 89 בתל אביב. עבד כרופא של בתי הספר בתל אביב. היה פעיל בארגוני הסופרים וחבר ב"וועד הלשון העברית". היה גם העורך של ספר מונחים בעברית לרפואה ולמדעי הטבע.

בשנת 1936 עברו אשתו ובתו להתגורר כדיירות-משנה במעון הפטריארך היווני בפסגת סן סימון בירושלים. לאחר שלקה בלוקמיה, הצטרף אליהן טשרניחובסקי. בתו נישאה לאברהם וילנסקי ועברה לחיפה. בני הזוג היו הורים לבן יחיד, אלכסנדר וילנסקי (לימים מהנדס).

שאול טשרניחובסקי נפטר בירושלים בט"ו בתשרי ה'תש"ד (1943), ונטמן בבית הקברות טרומפלדור בתל אביב.

אשתו מלניה, שהייתה לפראבוסלאבית אדוקה, עברה לאחר מותו להתגורר בבית בתהּ בחיפה. אף שחייתה בארץ ארבעים שנה, לא ידעה עברית (ולא יכלה לקרוא את יצירתו של בעלה). היא נפטרה בשיבה טובה ב-1971 ונקברה בחלקה היוונית-אורתודוקסית במתחם בתי הקברות בחיפה.‏ בתם נפטרה ב-1974.לאחר מותה, עברו זכויות היוצרים על יצירתו של שאול טשרניחובסקי לאברהם וילנסקי, שההדיר את עזבונו הספרותי ודאג להוצאת כתביו (תחילה בהוצאת דביר ואחר-כך בעם עובד).